腓特烈二世与教皇格列高利九世之间的主要矛盾集中在以下几个方面：
权力冲突：腓特烈二世作为神圣罗马帝国皇帝，试图在政治和宗教上保持独立，而教皇格列高利九世则试图维护教皇对基督教世界的绝对权威。这种权力的争夺导致了两者之间的紧张关系。
叙任权斗争：这是中世纪西欧教会与世俗君主之间的一系列冲突事件，矛盾双方为教会和世俗君主。腓特烈二世与教皇之间的斗争可以看作是叙任权斗争的延续。
十字军东征：腓特烈二世在教皇的绝罚令威胁下，不得不率军参与东征，但他并没有按照教皇的意愿行事，而是通过和谈等方式来达成目标，这进一步加剧了双方的矛盾。
对教皇国的态度：腓特烈二世完全不把教皇国放在眼里，与教皇格列高利九世更是矛盾重重。
个人恩怨：1234年，教皇支持腓特烈二世的儿子亨利七世反对自己的父亲，腓特烈二世很快扑灭叛乱，并废除儿子的王位。
教皇的绝罚：格里高利九世以不恭顺教皇为由对腓特烈二世采取了两次“绝罚”，但腓特烈二世并未因此受到影响，反而通过外交手段化解了危机。
这些矛盾最终导致了两者之间的激烈对抗，影响了中世纪欧洲的政治和宗教格局。