哈迪-温伯格定律的应用条件十分严格，只有在某些理想状态下才能完全满足。主要有以下几个关键条件：
群体无限大：理论上，群体需要有无限数量的个体，以避免基因频率因抽样误差产生的随机漂变。这一条件在实际中难以完全满足，因为现实中的种群都是有限的【5】【7】。
随机交配：群体中的个体必须随机交配，任何形式的偏好交配（如近亲繁殖或选择性繁殖）都会影响等位基因的频率【6】。
无突变：在群体内，基因不发生突变。突变会引入新的等位基因，从而改变基因频率【5】。
无迁移：没有新的个体从外部迁入或迁出，确保群体的基因库保持稳定【7】【8】。
无自然选择：没有任何等位基因由于生存优势而被选择出来，所有个体的生存和繁殖能力相同【7】。
这些条件在自然界中很难全部满足，因此哈迪-温伯格平衡更多作为一种理想状态，用来作为基准观察实际种群的偏离程度【8】。在实际研究中，科学家常使用该定律检测种群是否符合遗传平衡，从而推断是否存在如自然选择、迁移或突变等进化因素【6】。